過硫酸氫鉀復(fù)合鹽粉對(duì)水產(chǎn)病原菌的殺滅效果

過硫酸氫鉀復(fù)合鹽粉對(duì)水產(chǎn)病原菌的殺滅效果

孫文博，章志強(qiáng)，李慶，曹楊洋，張高峰，楊輝*

（1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇永榮生物科技有限公司，江蘇 連云港 222062）

細(xì)菌性疾病一直是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素[1]，不僅導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物大量死亡，還會(huì)引發(fā)病毒性疾病暴發(fā)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大威脅[2]?？刂扑a(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中病原菌的數(shù)量，對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物疫病防控至關(guān)重要。目前，水產(chǎn)動(dòng)物病害防控的關(guān)鍵技術(shù)體系包括病原檢測(cè)、微生態(tài)制劑施用、水產(chǎn)消毒劑、中草藥和抗生素的應(yīng)用[3]。其中，化學(xué)類消毒劑可以抑制或殺滅水體中的病原微生物，降低水體中病原菌的豐度，在阻止細(xì)菌性疾病的傳播和暴發(fā)方面，發(fā)揮著重要作用[4]。由于成本較低且效果顯著，化學(xué)類消毒劑目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到廣泛應(yīng)用。水產(chǎn)養(yǎng)殖中化學(xué)類消毒劑的使用缺乏科學(xué)指導(dǎo)，濫用消毒劑會(huì)給養(yǎng)殖水環(huán)境帶來危機(jī)。因此，研發(fā)環(huán)境友好型的水產(chǎn)養(yǎng)殖消毒劑，并科學(xué)指導(dǎo)其應(yīng)用，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，具有重要意義。

過硫酸氫鉀復(fù)合鹽粉（2KHSO5·K2SO4·KHSO4，簡(jiǎn)稱PMS），是一種由單過硫酸氫鉀（KHSO5,PMPS）、硫酸氫鉀（KHSO4）和硫酸鉀（K2SO4）為主，輔以表面活性劑、無機(jī)酸和有機(jī)酸等組合而成的一種新型的過氧化物類消毒劑。PMS 能夠溶于水，分解產(chǎn)物為無害的無機(jī)鹽，并在水體中產(chǎn)生高活性的自由基和活性氧等物質(zhì)，通過氧化作用有效殺滅各種病原微生物，具有廣譜的殺菌作用、高安全性和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)[5]。PMS 還能降解養(yǎng)殖水體中的氨氮，提高溶解氧水平，促進(jìn)污泥顆粒的分解，從而改善水質(zhì)和底質(zhì)[6-7]。目前PMS 已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜牧業(yè)、污水處理和醫(yī)療環(huán)境消毒等領(lǐng)域。然而關(guān)于PMS 對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖相關(guān)病原細(xì)菌的殺滅效果尚不明確，而且不同生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品質(zhì)量也存在差異，使得選擇高質(zhì)量產(chǎn)品變得困難?，F(xiàn)選取水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的8 種病原細(xì)菌為試驗(yàn)菌株，分析PMS 在不同濃度下的殺菌動(dòng)力學(xué)參數(shù)，同時(shí)比較了某國(guó)產(chǎn)品牌和某進(jìn)口品牌生產(chǎn)商生產(chǎn)PMS的殺菌效果，為實(shí)際生產(chǎn)中的合理使用及后續(xù)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 時(shí)間與地點(diǎn)

2023 年4—7 月。試驗(yàn)地位于江蘇省揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)室。

1.2 材料

某國(guó)產(chǎn)品牌（A 產(chǎn)品）和某進(jìn)口品牌（B 產(chǎn)品）生產(chǎn)商生產(chǎn)的PMS（以下簡(jiǎn)稱A-PMS、B-PMS）均為50%粉劑（含有50%的PMS）。8 種病原細(xì)菌為維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）（ATCC 35622）、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）（BNCC186123）、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）（BNCC133264）、河流弧菌（Vibrio fluvialis）（BNCC337051）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）（ATCC33787）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）（BNCC138541）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum）（BNCC354817）和殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）（CCTCC208068），均為商品化的標(biāo)準(zhǔn)菌株。其中維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、大腸埃希氏菌、河流弧菌、殺魚愛德華氏菌、溶藻弧菌和鰻弧菌使用LB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，副溶血弧菌使用2216E 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng)及抑菌試驗(yàn)

各菌珠經(jīng)LB 平板或2216E 瓊脂培養(yǎng)基活化后，挑選單克隆菌株，接種于200 mL 相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，并將其放置于恒溫?fù)u床（28 ℃/37 ℃，180 r/min）中連續(xù)培養(yǎng)24 h 以上，6 000 r/min 離心5 min，收集菌體，并用無菌PBS 磷酸鹽緩沖液洗滌2～3 次，做成菌懸液待用。將50%A-PMS 粉劑溶解于無菌水中，并分別配置成1，10，50，100 和200 mg/L的濃度。將配置好的PMS 溶液取10 μL，分別加入1 mL稀釋后的8 種菌液中，稀釋100 倍，使得PMS 的終濃度分別為0，0.01，0.10，0.50，1.00 和2.00 mg/L。對(duì)細(xì)菌懸液計(jì)數(shù)，并進(jìn)行稀釋，確保菌懸液中細(xì)菌菌落數(shù)少于2×104cfu/mL，以避免菌落數(shù)太多致無法準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。將不同濃度的PMS與菌液搖勻后，室溫下靜置處理，并分別在0.5，1.0，1.5 和2.0 h 時(shí)，取100 μL 混合液涂布在LB或2216E 營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，倒置放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后對(duì)平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.2 A-PMS、B-PMS 殺菌效果比對(duì)試驗(yàn)

將A-PMS、B-PMS 粉劑稀釋至終濃度為0.5，1.0，10.0 和50.0 mg/L。所選用的菌株與培養(yǎng)處理的方法同1.2，但僅在處理2 h 時(shí)進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)，計(jì)算其殺菌效率。

1.3.3 PMS 對(duì)降低鯽感染維氏氣單胞菌的死亡率試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證PMS 對(duì)養(yǎng)殖水體病原細(xì)菌的殺滅作用，分析PMS 對(duì)通過人工浸泡感染維氏氣單胞菌鯽死亡率的影響。選擇的鯽體質(zhì)量為（0.52±0.18）g，體長(zhǎng)（3.44±0.37）cm。試驗(yàn)魚暫養(yǎng)在5 L 的透明亞克力水槽中，連續(xù)曝氣，控溫在25 ℃，每個(gè)水槽中暫養(yǎng)30 尾鯽，共6 個(gè)水槽。感染試驗(yàn)分為2 組，分別為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組3 個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)組和對(duì)照組的養(yǎng)殖水體中均添加過夜培養(yǎng)的維氏氣單胞菌，浸泡感染的細(xì)菌濃度控制在106～107cfu/mL。試驗(yàn)組每天往水體中添加A-PMS 至2 mg/L，試驗(yàn)持續(xù)5 d，統(tǒng)計(jì)鯽的累計(jì)死亡率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件作圖，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析組間數(shù)據(jù)的差異性，試驗(yàn)組與對(duì)照組P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMS 對(duì)不同病原菌的殺滅效果

PMS 對(duì)8 種不同病原菌的殺滅效果見表1。由表1 可見，PMS 對(duì)常見菌的殺菌效果不具有特異性。在相同處理時(shí)間下，PMS 的濃度越高，菌落數(shù)量越少，殺菌率越高。在2 mg/L 的濃度下，處理時(shí)間超過1.5 h，殺菌率基本可以達(dá)到100%。

表1 不同濃度的PMS 2 h 內(nèi)對(duì)各細(xì)菌的殺菌率%

2.2 A-PMS、B-PMS 殺菌效果對(duì)比

A-PMS、B-PMS 對(duì)8 種不同病原菌的殺滅效果見表2。由表2 可見，在高濃度（5.0 mg/L）下，這2 種產(chǎn)品對(duì)所選的8 種常見病原菌都表現(xiàn)出良好的殺菌活性，幾乎能完全殺滅該濃度下的病原菌。在低濃度（0.5 和1.0 mg/L）下，A-PMS 對(duì)維氏氣單胞菌（A. veronii）、嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）、大腸桿菌（E. coli）、河流弧菌（V. fluvialis）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、殺魚愛德華菌（E. piscicida）和副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）表現(xiàn)出更高效的殺菌活性。這一結(jié)果間接證明了不同廠家生產(chǎn)的PMS 產(chǎn)品之間的差異性，A-PMS 則展現(xiàn)出更好的殺菌效果。

表2 不同濃度的2 種品牌產(chǎn)品對(duì)細(xì)菌的殺菌率%

2.3 PMS 對(duì)鯽感染維氏氣單胞菌的累計(jì)存活率

采用累計(jì)生存曲線，統(tǒng)計(jì)了A-PMS對(duì)鯽感染維氏氣單胞菌的累計(jì)存活率，結(jié)果見圖1。由圖1 可見，對(duì)照組鯽感染細(xì)菌后的存活率，顯著降低，經(jīng)過5 d，累計(jì)存活率僅為43%；而試驗(yàn)組在水體中使用2 mg/L 的A-PMS 進(jìn)行消殺，5 d 后的累計(jì)存活率為76%。由累計(jì)存活率曲線可見，使用A-PMS 處理養(yǎng)殖水體后，能夠顯著提高鯽感染維氏氣單胞菌的累計(jì)存活率。

圖1 PMS 對(duì)鯽感染維氏氣單胞菌累計(jì)存活率

3 討論

3.1 PMS 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的強(qiáng)效殺菌機(jī)理及影響因素

PMS 具有強(qiáng)大且有效的非氯氧化能力，為應(yīng)用廣泛的畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖的消毒劑和水質(zhì)改良劑[8-9]。作為化學(xué)類消毒劑，PMS 的殺菌原理主要是利用其強(qiáng)氧化性，在直接與菌體或酶蛋白中的氨基、羧基、巰基等發(fā)生反應(yīng)的過程中損傷細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)或抑制代謝功能，從而導(dǎo)致其死亡[10]。研究指出，PMS的消殺活性受養(yǎng)殖水體中有機(jī)物濃度、溫度和pH值的影響[11]。除了殺滅細(xì)菌外，PMS 還能氧化水體中的有機(jī)物，因此也會(huì)影響對(duì)病原細(xì)菌的消殺效果。因此，在評(píng)估PMS 對(duì)病原菌的殺滅活性時(shí)，傳統(tǒng)的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測(cè)定方法不適用，需要采用類似于本試驗(yàn)中分析PMS 對(duì)不同細(xì)菌的殺菌動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法[12-13]。盡管本試驗(yàn)中PMS 對(duì)不同病原菌的殺滅效率存在一定差異，但隨著PMS 濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，2 mg/L 的PMS 處理2 h，已經(jīng)能夠顯著殺滅104cfu/mL 的病原細(xì)菌，表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌效果。PMS 的殺菌效果與濃度、處理時(shí)間以及初始菌體數(shù)量顯著相關(guān)，但其對(duì)不同細(xì)菌的殺滅特異性則不明顯。有研究[14]指出，10～60 mg/L 的PMS，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等不同病原微生物處理5 min，其殺滅率均＞99%。1 250 mg/L 的PMS 對(duì)溶血性鏈球菌和多殺性巴氏桿菌作用2.5 min，殺菌對(duì)數(shù)值＞5[15]。PMS 對(duì)黃顙魚2 種病原菌溫和氣單胞菌和弗氏檸檬酸桿菌的殺菌濃度分別在31.25 和125.00 mg/L[16]。上述研究表明,PMS 能夠顯著殺滅病原菌，而殺菌效果差異,主要與PMS 的來源和檢測(cè)方法有關(guān)。而本試驗(yàn)中，排除了培養(yǎng)基中蛋白胨和酵母粉等有機(jī)物的干擾，直接展示了PMS 對(duì)病原菌的殺滅效果，其結(jié)果更能準(zhǔn)確反映PMS 對(duì)水產(chǎn)病原菌的直接殺滅活性。本試驗(yàn)所選的8 種病原菌均為水產(chǎn)常見致病菌，PMS 對(duì)其殺滅效果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控提供了更有效的參考依據(jù)。

3.2 PMS 在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的效果與安全性

目前市場(chǎng)上銷售的PMS 主要以過硫酸氫鉀復(fù)合鹽為主要成分，同時(shí)添加了絡(luò)合劑、增效劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、氯化鈉、有機(jī)酸等輔料進(jìn)行配制。由于不同廠家的配方、生產(chǎn)工藝和原材料等因素的差異，生產(chǎn)出的PMS 產(chǎn)生的效果各不相同，質(zhì)量良莠不齊[17]。在本試驗(yàn)中，2 種PMS 產(chǎn)品在高濃度下對(duì)病原細(xì)菌的殺滅效果一致，但在低濃度下，A-PMS 表現(xiàn)出更高的殺菌效率，這也證實(shí)了市面上PMS 產(chǎn)品效果的差異性。文獻(xiàn)[18]研究指出，1 kg 體質(zhì)量小鼠，急性經(jīng)口毒性半數(shù)致死量（LD50）＞4 207 mg。在對(duì)黃顙魚使用PMS 毒性研究[19]中，PMS 使用的安全濃度為8.5 mg/L。PMS 對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物的毒性研究相對(duì)較少。文獻(xiàn)[20]研究表明，水體中投加PMS 消毒后，造成的遺傳毒性顯著低于次氯酸鈉消毒，產(chǎn)生的鹵代烴和鹵代物生成較少，這也表明PMS 用于消毒仍有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。而本試驗(yàn)中，PMS 顯著提高了鯽感染維氏氣單胞菌后的累計(jì)存活率，并未表現(xiàn)出明顯的藥物毒性，這說明PMS 是一種有效的預(yù)防和治療水產(chǎn)細(xì)菌性疾病的藥物。