論文：鯉皰疹病毒2 型不同分離株的基因組比較分析

鯉皰疹病毒2 型不同分離株的基因組比較分析

周怡，趙路品，劉笑茹，姜有聲

（1.上海海洋大學，國家水生動物病原庫，上海 201306；2.上海海洋大學，水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；3.上海海洋大學，水產(chǎn)動物遺傳育種中心上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306）

1 鯉皰疹病毒2 型

1.1 流行病學

CyHV-2 又稱為皰疹病毒性造血器官壞死病毒（Herpesviral haematopoietic necrosis, HVHNV）、金魚造血器官壞死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV），與鯉痘皰疹病毒（Carp pox virus，又稱鯉皰疹病毒I 型CyHV-1）、錦鯉皰疹病毒（Koi herpesvirus，KHV，又稱鯉皰疹病毒III 型，CyHV-3）同屬于皰疹病毒目（Herpesvi rales）、異皰疹病毒科（Alloherpesviridae）、鯉皰疹病毒屬（Cyprini-virus）[1-2]。CyHV-2 的感染性強，致死率高，魚體感染病毒出現(xiàn)癥狀后，24～48 h 即死亡。主要臨床癥狀為體表廣泛性充血或出血、鰓絲腫脹；解剖發(fā)現(xiàn)，患病魚的鰓和肝胰臟蒼白。CyHV-2 引起異育銀鯽鰓出血病，主要發(fā)生在春秋兩季[3-9]。CyHV-2 的傳播方式主要為垂直傳播和水平傳播[10-11]。

1.2 病原學

CyHV-2 是一種線性雙鏈DNA 病毒，其基因組全長約290 kbp，基因組共編碼154 個開放閱讀框（Open reading frame, ORF），其中有4 個末端重復序列（Terminal repeat, TR）和2 個無編碼功能的碎片基因[12]。CyHV-2 的核衣殼呈六角形或球形，直徑為115～117 nm，具有皮質(zhì)層和囊膜的完整病毒顆粒直徑為170～220 nm[2，13]。Gao 等[14]利用蔗糖密度梯度，結合超離心純化病毒粒子，鑒定了CyHV-2 的結構蛋白，通過SDS-PAGE分離病毒蛋白，并用質(zhì)譜法進行鑒定，結果顯示，CyHV-2 含有74 種蛋白，其中包含3 種衣殼蛋白、18 種膜蛋白和8 種主要免疫原性蛋白。文獻[7，15]建立異育銀鯽腦細胞系（Brain cell lines of Carassius auratus gibelio, GiCB），研究CyHV-2的理化及生物學特性，發(fā)現(xiàn)其對酸堿度和有機溶劑敏感。

1.3 患病金魚、鯽狀態(tài)比較

CyHV-2 對金魚和鯽表現(xiàn)出較高的易感性，對金魚（父本）和鯉（母本）的雜交個體也表現(xiàn)出易感性，但錦鯉不易被感染，雜交個體對CyHV-2 的敏感性低于金魚和鯽[16]。發(fā)病的金魚和異育銀鯽，其生活的水溫存在一定差異[17]，金魚在水溫＞25 ℃時，存在感染發(fā)病情況。Xu 等[6]試驗發(fā)現(xiàn)，異育銀鯽在水溫15～32 ℃的池塘中會暴發(fā)疾病，并指出該病暴發(fā)的最適溫度為20～28 ℃。在水溫25 ℃時，CyHV-2 對金魚和鯽的致死率都很高；＞25 ℃時，其發(fā)病狀態(tài)則存在一定差異，不同的宿主感染后，呈現(xiàn)出不同的病理變化。鯽和異育銀鯽患病后，鰓部明顯出血，尾鰭末端發(fā)白，體表無寄生蟲附著，鯽有少量紅色腹水，鰾有點狀出血，部分異育銀鯽體內(nèi)有淺黃色腹水，魚鰾上有明顯出血性瘀斑，一些患病死亡的異育銀鯽，鰓絲因失血而呈蒼白色，在鰓蓋兩側(cè)各形成一個胭脂紅色的淤血斑塊[8，18-19]?；疾〗痿~的鰓蒼白，脾和腎臟腫脹并呈蒼白色，偶爾能見多處白色病灶，肝蒼白，腸道空，鰾上有瘀斑性出血，鰭上有水泡狀膿皰，有些患病魚的腹部膨大，眼球突出[8]。

2 CyHV-2 毒株的基因組比較

通過核苷酸序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）數(shù)據(jù)庫查找，鯉皰疹病毒2 型共有7 個分離株進行了全基因組測序（表1、2），按照時間順序，分別為ST-J1、YC-01、SY-C1、1301、SY、YZ-01 和CNDF-TB2015，它們的基因組大小為275 348～290 455 bp。除了CNDF-TB2015 株是環(huán)狀DNA，其余毒株都是線狀DNA。

表1 分離株來源信息

表2 7 株分離株的基因組信息①

李莉娟等[13]研究了從國內(nèi)患病鯽體內(nèi)分離的毒株SY-C1 的基因組特征，并與日本株ST-J1 進行了比較基因組學分析，結果表明，2 個毒株序列的同源性為98.8%，在CyHV-2 基因組中唯一區(qū)域和末端重復序列的同源性分別為99%和97.6%，說明該2 個毒株的基因組在核苷酸序列水平上高度相似；通過進一步比較發(fā)現(xiàn)，SY-C1 的單核苷酸突變、插入、缺失和重排等，與ST-J1 存在明顯變異，這2 個毒株的主要差異是SY-C1 基因組在ORF25B 和ORF25C 之間具有一個523 nt 的缺失，這也是2 個毒株基因組最顯著的差異。SY-C1 基因組中ORF55編碼胸苷激酶（TK）參與核酸代謝，與ST-J1 基因組的不同之處，在于它包含了9 nt 的缺失，此明顯差異，也可以用來區(qū)別2 個株型。SY-C1 基因組中的3個核心ORF（ORF33、ORF79、ORF107）與ST-J1 基因組中的ORF33、ORF79、ORF107 相同，在其余核心ORF 中兩者之間，只有1～3 個氨基酸存在差異[13]。這2 個毒株被分為C 基因型（中國基因型）和J 基因型（日本基因型），國內(nèi)分離的CyHV-2 毒株更接近C 基因型。

SY 基因組全序列具有154 個ORF 和15 353 bp的TR，總（G+C）含量約為51.6%[20]。生物信息學分析表明，SY 基因組具有10 個ORF 編碼膜蛋白，3 個ORF 編碼核衣殼蛋白。CaHV（分離株1 301）的片段長度為275 348 bp，包含150 個ORF，（G+C）含量為51.73%，不含TR[21]。CaHV 中的19 個ORF 與SY-C1 中同源物的同源性低于95%，9 個ORF 與ST-J1 中同源物的同源性低于95%。SY、ST-J1 和SY-C13 個毒株之間存在67 個ORF，沒有任何變異，這表明CyHV-2 與自身宿主發(fā)生了協(xié)同進化，宿主的適應性，導致了不同毒株的基因差異。

將ST-J1、SY-C1、SY、CaHV 的序列進行對比，發(fā)現(xiàn)ST-J1 和SY-C1 的ORF10 中有2 個富含谷氨酰胺的串聯(lián)重復序列，而SY 和CaHV 在這串聯(lián)重復序列之間多了一個含有組氨酸和酪氨酸插入的重復；核心基因ORF107 的串聯(lián)重復序列DELD 在ST-J1 和SY-C1 中復制2 次，在SY 和CaHV 中復制1 次；PTVTGITQQS 序 列 在ST-J1 和SY-C1 的ORF156 中重復6 次，在SY 中重復3 次。ORF10 和ORF107 可作為SY 和CaHV 的標志，以區(qū)別于STJ1 和SY-C1，ORF156 可作為SY 的標志以區(qū)別于CaHV。與ST-J1 基因組相比，SY-C1 基因組在ORF25B 和ORF25C 之間存在523 nt 的缺失，在SY和CaHV 基因組中也發(fā)現(xiàn)了相同的缺失。ST-J1 基因組串聯(lián)重復序列在ORF6 和ORF7 之間，有一個87 bp 的DNA 片段，該片段在SY-C1、SY、CaHV 中不存在[20]。此外，ST-J1 在ORF25C 和ORF48 的右側(cè)具有220 bp 的反向重復序列，但在SY-C1、SY 和CaHV 中沒有發(fā)現(xiàn)該序列。這些發(fā)現(xiàn)，表明SY-C1、SY 和CaHV 在進化過程中具有密切關系。

Wang 等[22]運用PhyML 在線構建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，YZ-01 更接近YC-01，與SY-C1、CNDF-TB2015、1301、YC-01 屬于同一組。通過DNAMAN 軟件比較YC-01、YZ-01 和CNDF-TB2015 的ORF 發(fā)現(xiàn)，除假設蛋白外，三者具有44 個相似的ORF，其中15 個ORF 的相似性達到了100%（例如CNDF-TB2015 的ORF13R、ORF16R、ORF17R 和YC-01、YZ-01 的ORF23、ORF25、ORF25B），17 個ORF 的相似性超過99%。與YC-01 和YZ-01 的ORF80、ORF138 相比，CNDF-TB2015 的ORF86L 和ORF140R 分別具有865 bp（139 829～140 717 個核苷酸）和88 bp（207 246 個核苷酸～207 333 個核苷酸）的片段，這2 個ORF 可作為CNDF-TB2015 的標志以區(qū)別于YC-01 和YZ-01。YC-01 的ORF64 和ORF142A 分別有一個39 bp（101 648～101 686 個核苷酸）、42 bp（213 375～213 416 個核苷酸）的片段，該2 個片段在YZ-01 不存在。此外，YZ-01 的ORF25C 比YC-01 的ORF25C，多出一個711 bp 的片段（32 108 ～32 818 個核苷酸）。雖然其余7 個ORF 或多或少存在堿基的缺失、替換，但其相似性也達到了90%。

對Genbank 中7 個CyHV-2 分離株的全基因組分析表明，雖然所有分離株的基因組具有很高的同源性，但是不同的分離株，在其基因組中包含很多突變、插入、缺失和重排。7 個分離株具有134 個相似的ORF，通過DNAMAN 軟件進行序列比對發(fā)現(xiàn)，24 個ORF 沒有發(fā)生變化（相似性100%），98 個ORF 比較穩(wěn)定（相似性≥90%，不包括100%），12 個ORF 突變較多（相似性＜90%），見表3 和4。

表3 7 株分離株之間的同源性① %

表4 7 株分離株相似ORF 的比較①

3 CyHV-2 基因功能

7 個分離株的基因組具有12 個高度保守的ORF（ORF33、ORF46、ORF47、ORF61、ORF71、ORF72、ORF78、ORF79、ORF80、ORF90、ORF92、ORF107），但YZ-01 株的基因組缺少ORF33。這些蛋白都具有編碼功能，如ORF33 編碼DNA 包裝末端酶亞基1，ORF71 編碼DNA 解旋酶亞基，ORF72 編碼病毒衣殼三聯(lián)體亞基2，ORF78 編碼衣殼成熟蛋白酶，ORF79 編碼DNA 聚合酶亞基等[23]。

CyHV-2 ORFs 中只有少數(shù)的功能得到確認，如ORF25、ORF25C 和ORF25D 能夠編碼膜蛋白[24]；ORF104 編碼類激酶蛋白，定位于細胞核，與p38 的上游激活子MKK3/MKK6 具有很高的相似性，可以特異性激活p38 MAPK 信號通路，但不能激活JNK 和ERK，而p38 通路的阻斷顯著提高了感染CyHV-2 銀鯽的存活率[25]。金李萍等[26]在異育銀鯽脊髓細胞系（Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio, CSC）中，對CyHV-2 ORF57 進行RNA 干擾，結果顯示，干擾ORF57 的表達可大幅度降低CyHV-2 的致細胞病變力和復制率，ORF57 在CyHV-2 復制和致細胞病變中起重要作用。

周勇等[27]比較分析了CyHV-2 部分基因的序列差異，包括ORF25、ORF25B、ORF25D、ORF55 和ORF72，結果表明，ORF25 編碼蛋白具有較好的免疫原性。魯建飛[28]將8 條miRNA mimics 轉(zhuǎn)染至GiCF細胞，發(fā)現(xiàn)miR-C12 抑制CyHV-2 誘導的GiCF 細胞凋亡，為進一步探討miR-C12 的調(diào)控機制，將miR-C12 mimics、miR-C12 inhibitor、CASP-siRNA-1 轉(zhuǎn)染細胞，結果表明，miR-C12 mimics 和CASPsiRNA-1 均能促進CyHV-2 復制，miR-C12 inhibitor抑制CyHV-2 復制。Wang 等[29]對5 種RING 蛋白（39L、52L、131R、143R）進行了亞細胞定位、泛素化活性等分析，結果表明，RING 結構域外的序列，決定了亞細胞定位和泛素化活性水平，RING 蛋白可能在病毒和宿主的相互作用中具有不同的功能。文獻[30]研究表明，某些DNA 病毒可以編碼環(huán)狀RNA（circRNA）來調(diào)節(jié)病毒感染，circ-udg 是一種來自Cy－HV-2 尿嘧啶DNA 糖基化酶（udg）基因的circRNA，可以促進CyHV-2 復制。CyHV-2 編碼17 個miRNA，其中miR-C12 通過靶向半胱天冬酶8，抑制病毒誘導的細胞凋亡并促進病毒復制[31]。

4 結語

目前，CyHV-2 在世界范圍內(nèi)不斷的流行并蔓延，嚴重危害多個國家的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。盡管相關研究人員采取了多種方法，由CyHV-2 引起的疾病仍對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。隨著測序技術的進步，現(xiàn)在已有7 個CyHV-2 毒株的全基因組，雖然這7 個基因組具有很高的同源性，但都有其標志性ORF。未來應以CyHV-2 的基因組序列為基礎，加強對CyHV-2 的基因功能以及宿主對Cy HV-2 的免疫反應等基礎研究，同時加強國際交流合作，以研究出更具體、更有效的預防、控制和治療方法，遏制病毒的傳播擴散。