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        論文:鯉皰疹病毒2 型不同分離株的基因組比較分析

        發表時間:2024/02/02 12:02:30  來源:水產養殖 2023年6期  瀏覽次數:891  
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        鯉皰疹病毒2 型不同分離株的基因組比較分析

        周怡,趙路品,劉笑茹,姜有聲

        (1.上海海洋大學,國家水生動物病原庫,上海 201306;2.上海海洋大學,水產科學國家級實驗教學示范中心,上海 201306;3.上海海洋大學,水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心,上海 201306)

        1 鯉皰疹病毒2 型

        1.1 流行病學

        CyHV-2 又稱為皰疹病毒性造血器官壞死病毒(Herpesviral haematopoietic necrosis, HVHNV)、金魚造血器官壞死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV),與鯉痘皰疹病毒(Carp pox virus,又稱鯉皰疹病毒I 型CyHV-1)、錦鯉皰疹病毒(Koi herpesvirus,KHV,又稱鯉皰疹病毒III 型,CyHV-3)同屬于皰疹病毒目(Herpesvi rales)、異皰疹病毒科(Alloherpesviridae)、鯉皰疹病毒屬(Cyprini-virus)[1-2]。CyHV-2 的感染性強,致死率高,魚體感染病毒出現癥狀后,24~48 h 即死亡。主要臨床癥狀為體表廣泛性充血或出血、鰓絲腫脹;解剖發現,患病魚的鰓和肝胰臟蒼白。CyHV-2 引起異育銀鯽鰓出血病,主要發生在春秋兩季[3-9]。CyHV-2 的傳播方式主要為垂直傳播和水平傳播[10-11]。

        1.2 病原學

        CyHV-2 是一種線性雙鏈DNA 病毒,其基因組全長約290 kbp,基因組共編碼154 個開放閱讀框(Open reading frame, ORF),其中有4 個末端重復序列(Terminal repeat, TR)和2 個無編碼功能的碎片基因[12]。CyHV-2 的核衣殼呈六角形或球形,直徑為115~117 nm,具有皮質層和囊膜的完整病毒顆粒直徑為170~220 nm[2,13]。Gao 等[14]利用蔗糖密度梯度,結合超離心純化病毒粒子,鑒定了CyHV-2 的結構蛋白,通過SDS-PAGE分離病毒蛋白,并用質譜法進行鑒定,結果顯示,CyHV-2 含有74 種蛋白,其中包含3 種衣殼蛋白、18 種膜蛋白和8 種主要免疫原性蛋白。文獻[7,15]建立異育銀鯽腦細胞系(Brain cell lines of Carassius auratus gibelio, GiCB),研究CyHV-2的理化及生物學特性,發現其對酸堿度和有機溶劑敏感。

        1.3 患病金魚、鯽狀態比較

        CyHV-2 對金魚和鯽表現出較高的易感性,對金魚(父本)和鯉(母本)的雜交個體也表現出易感性,但錦鯉不易被感染,雜交個體對CyHV-2 的敏感性低于金魚和鯽[16]。發病的金魚和異育銀鯽,其生活的水溫存在一定差異[17],金魚在水溫>25 ℃時,存在感染發病情況。Xu 等[6]試驗發現,異育銀鯽在水溫15~32 ℃的池塘中會暴發疾病,并指出該病暴發的最適溫度為20~28 ℃。在水溫25 ℃時,CyHV-2 對金魚和鯽的致死率都很高;>25 ℃時,其發病狀態則存在一定差異,不同的宿主感染后,呈現出不同的病理變化。鯽和異育銀鯽患病后,鰓部明顯出血,尾鰭末端發白,體表無寄生蟲附著,鯽有少量紅色腹水,鰾有點狀出血,部分異育銀鯽體內有淺黃色腹水,魚鰾上有明顯出血性瘀斑,一些患病死亡的異育銀鯽,鰓絲因失血而呈蒼白色,在鰓蓋兩側各形成一個胭脂紅色的淤血斑塊[8,18-19]?;疾〗痿~的鰓蒼白,脾和腎臟腫脹并呈蒼白色,偶爾能見多處白色病灶,肝蒼白,腸道空,鰾上有瘀斑性出血,鰭上有水泡狀膿皰,有些患病魚的腹部膨大,眼球突出[8]。

        2 CyHV-2 毒株的基因組比較

        通過核苷酸序列數據庫(GenBank)數據庫查找,鯉皰疹病毒2 型共有7 個分離株進行了全基因組測序(表1、2),按照時間順序,分別為ST-J1、YC-01、SY-C1、1301、SY、YZ-01 和CNDF-TB2015,它們的基因組大小為275 348~290 455 bp。除了CNDF-TB2015 株是環狀DNA,其余毒株都是線狀DNA。

        表1 分離株來源信息

        表2 7 株分離株的基因組信息①

        李莉娟等[13]研究了從國內患病鯽體內分離的毒株SY-C1 的基因組特征,并與日本株ST-J1 進行了比較基因組學分析,結果表明,2 個毒株序列的同源性為98.8%,在CyHV-2 基因組中唯一區域和末端重復序列的同源性分別為99%和97.6%,說明該2 個毒株的基因組在核苷酸序列水平上高度相似;通過進一步比較發現,SY-C1 的單核苷酸突變、插入、缺失和重排等,與ST-J1 存在明顯變異,這2 個毒株的主要差異是SY-C1 基因組在ORF25B 和ORF25C 之間具有一個523 nt 的缺失,這也是2 個毒株基因組最顯著的差異。SY-C1 基因組中ORF55編碼胸苷激酶(TK)參與核酸代謝,與ST-J1 基因組的不同之處,在于它包含了9 nt 的缺失,此明顯差異,也可以用來區別2 個株型。SY-C1 基因組中的3個核心ORF(ORF33、ORF79、ORF107)與ST-J1 基因組中的ORF33、ORF79、ORF107 相同,在其余核心ORF 中兩者之間,只有1~3 個氨基酸存在差異[13]。這2 個毒株被分為C 基因型(中國基因型)和J 基因型(日本基因型),國內分離的CyHV-2 毒株更接近C 基因型。

        SY 基因組全序列具有154 個ORF 和15 353 bp的TR,總(G+C)含量約為51.6%[20]。生物信息學分析表明,SY 基因組具有10 個ORF 編碼膜蛋白,3 個ORF 編碼核衣殼蛋白。CaHV(分離株1 301)的片段長度為275 348 bp,包含150 個ORF,(G+C)含量為51.73%,不含TR[21]。CaHV 中的19 個ORF 與SY-C1 中同源物的同源性低于95%,9 個ORF 與ST-J1 中同源物的同源性低于95%。SY、ST-J1 和SY-C13 個毒株之間存在67 個ORF,沒有任何變異,這表明CyHV-2 與自身宿主發生了協同進化,宿主的適應性,導致了不同毒株的基因差異。

        將ST-J1、SY-C1、SY、CaHV 的序列進行對比,發現ST-J1 和SY-C1 的ORF10 中有2 個富含谷氨酰胺的串聯重復序列,而SY 和CaHV 在這串聯重復序列之間多了一個含有組氨酸和酪氨酸插入的重復;核心基因ORF107 的串聯重復序列DELD 在ST-J1 和SY-C1 中復制2 次,在SY 和CaHV 中復制1 次;PTVTGITQQS 序 列 在ST-J1 和SY-C1 的ORF156 中重復6 次,在SY 中重復3 次。ORF10 和ORF107 可作為SY 和CaHV 的標志,以區別于STJ1 和SY-C1,ORF156 可作為SY 的標志以區別于CaHV。與ST-J1 基因組相比,SY-C1 基因組在ORF25B 和ORF25C 之間存在523 nt 的缺失,在SY和CaHV 基因組中也發現了相同的缺失。ST-J1 基因組串聯重復序列在ORF6 和ORF7 之間,有一個87 bp 的DNA 片段,該片段在SY-C1、SY、CaHV 中不存在[20]。此外,ST-J1 在ORF25C 和ORF48 的右側具有220 bp 的反向重復序列,但在SY-C1、SY 和CaHV 中沒有發現該序列。這些發現,表明SY-C1、SY 和CaHV 在進化過程中具有密切關系。

        Wang 等[22]運用PhyML 在線構建的系統發育樹表明,YZ-01 更接近YC-01,與SY-C1、CNDF-TB2015、1301、YC-01 屬于同一組。通過DNAMAN 軟件比較YC-01、YZ-01 和CNDF-TB2015 的ORF 發現,除假設蛋白外,三者具有44 個相似的ORF,其中15 個ORF 的相似性達到了100%(例如CNDF-TB2015 的ORF13R、ORF16R、ORF17R 和YC-01、YZ-01 的ORF23、ORF25、ORF25B),17 個ORF 的相似性超過99%。與YC-01 和YZ-01 的ORF80、ORF138 相比,CNDF-TB2015 的ORF86L 和ORF140R 分別具有865 bp(139 829~140 717 個核苷酸)和88 bp(207 246 個核苷酸~207 333 個核苷酸)的片段,這2 個ORF 可作為CNDF-TB2015 的標志以區別于YC-01 和YZ-01。YC-01 的ORF64 和ORF142A 分別有一個39 bp(101 648~101 686 個核苷酸)、42 bp(213 375~213 416 個核苷酸)的片段,該2 個片段在YZ-01 不存在。此外,YZ-01 的ORF25C 比YC-01 的ORF25C,多出一個711 bp 的片段(32 108 ~32 818 個核苷酸)。雖然其余7 個ORF 或多或少存在堿基的缺失、替換,但其相似性也達到了90%。

        對Genbank 中7 個CyHV-2 分離株的全基因組分析表明,雖然所有分離株的基因組具有很高的同源性,但是不同的分離株,在其基因組中包含很多突變、插入、缺失和重排。7 個分離株具有134 個相似的ORF,通過DNAMAN 軟件進行序列比對發現,24 個ORF 沒有發生變化(相似性100%),98 個ORF 比較穩定(相似性≥90%,不包括100%),12 個ORF 突變較多(相似性<90%),見表3 和4。

        表3 7 株分離株之間的同源性① %

        表4 7 株分離株相似ORF 的比較①

        3 CyHV-2 基因功能

        7 個分離株的基因組具有12 個高度保守的ORF(ORF33、ORF46、ORF47、ORF61、ORF71、ORF72、ORF78、ORF79、ORF80、ORF90、ORF92、ORF107),但YZ-01 株的基因組缺少ORF33。這些蛋白都具有編碼功能,如ORF33 編碼DNA 包裝末端酶亞基1,ORF71 編碼DNA 解旋酶亞基,ORF72 編碼病毒衣殼三聯體亞基2,ORF78 編碼衣殼成熟蛋白酶,ORF79 編碼DNA 聚合酶亞基等[23]。

        CyHV-2 ORFs 中只有少數的功能得到確認,如ORF25、ORF25C 和ORF25D 能夠編碼膜蛋白[24];ORF104 編碼類激酶蛋白,定位于細胞核,與p38 的上游激活子MKK3/MKK6 具有很高的相似性,可以特異性激活p38 MAPK 信號通路,但不能激活JNK 和ERK,而p38 通路的阻斷顯著提高了感染CyHV-2 銀鯽的存活率[25]。金李萍等[26]在異育銀鯽脊髓細胞系(Spinal cord tissue cell lines of Carassius auratus gibelio, CSC)中,對CyHV-2 ORF57 進行RNA 干擾,結果顯示,干擾ORF57 的表達可大幅度降低CyHV-2 的致細胞病變力和復制率,ORF57 在CyHV-2 復制和致細胞病變中起重要作用。

        周勇等[27]比較分析了CyHV-2 部分基因的序列差異,包括ORF25、ORF25B、ORF25D、ORF55 和ORF72,結果表明,ORF25 編碼蛋白具有較好的免疫原性。魯建飛[28]將8 條miRNA mimics 轉染至GiCF細胞,發現miR-C12 抑制CyHV-2 誘導的GiCF 細胞凋亡,為進一步探討miR-C12 的調控機制,將miR-C12 mimics、miR-C12 inhibitor、CASP-siRNA-1 轉染細胞,結果表明,miR-C12 mimics 和CASPsiRNA-1 均能促進CyHV-2 復制,miR-C12 inhibitor抑制CyHV-2 復制。Wang 等[29]對5 種RING 蛋白(39L、52L、131R、143R)進行了亞細胞定位、泛素化活性等分析,結果表明,RING 結構域外的序列,決定了亞細胞定位和泛素化活性水平,RING 蛋白可能在病毒和宿主的相互作用中具有不同的功能。文獻[30]研究表明,某些DNA 病毒可以編碼環狀RNA(circRNA)來調節病毒感染,circ-udg 是一種來自Cy-HV-2 尿嘧啶DNA 糖基化酶(udg)基因的circRNA,可以促進CyHV-2 復制。CyHV-2 編碼17 個miRNA,其中miR-C12 通過靶向半胱天冬酶8,抑制病毒誘導的細胞凋亡并促進病毒復制[31]。

        4 結語

        目前,CyHV-2 在世界范圍內不斷的流行并蔓延,嚴重危害多個國家的水產養殖業。盡管相關研究人員采取了多種方法,由CyHV-2 引起的疾病仍對水產養殖業造成了巨大的經濟損失。隨著測序技術的進步,現在已有7 個CyHV-2 毒株的全基因組,雖然這7 個基因組具有很高的同源性,但都有其標志性ORF。未來應以CyHV-2 的基因組序列為基礎,加強對CyHV-2 的基因功能以及宿主對Cy HV-2 的免疫反應等基礎研究,同時加強國際交流合作,以研究出更具體、更有效的預防、控制和治療方法,遏制病毒的傳播擴散。

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