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        論文:一種快捷的單細胞藻類計數方法 ——運用Photoshop軟件分析細胞顯微圖像輪廓

        發表時間:2024/01/24 17:28:58  來源:漁業研究2016年3期   瀏覽次數:1104  
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        一種快捷的單細胞藻類計數方法
        ——運用Photoshop軟件分析細胞顯微圖像輪廓

        李茉莉1,喬琨2*

        (1.湖南農業大學生物科學技術學院,湖南 長沙 410128;2.福建省水產研究所,福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室,福建 廈門 361013)

        細胞計數是藻類培養、赤潮調查和環境監測中的一個重要環節。本文設計并測試了一種單細胞藻類計數方法:利用體視顯微鏡及配套的CCD數字成像系統,獲取固定體積樣品的全視野圖像,運用Photoshop軟件對細胞顯微圖像輪廓進行分析計數。根據細胞粒徑差異,實驗選取5種代表性單細胞藻類,分別采用新方法和顯微鏡計數法對其進行細胞密度測定。研究結果表明,新方法在測定亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)時,結果較顯微鏡計數明顯偏低。而在測定東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)和血紅哈卡藻(Akashiwosanguinea)時,計數結果與顯微鏡計數結果非常接近,較可信。其計數結果與顯微鏡計數結果具有較好的線性相關性(R2≥0.981 1,P<0.01)。新方法能夠有效測定粒徑15 μm以上純種或混合培養的單細胞藻類的生物量,簡化了測定程序的同時,減少了人為誤差,具有一定的應用價值。

        單細胞藻類;藻類計數方法;Photoshop軟件分析;細胞顯微圖像輪廓

        在微藻培養和赤潮監測中,一般需要定時定點分析生物量來確定細胞生長狀態及增殖情況。隨著科技的進步,目前生物量測定的方法很多,包括顯微鏡計數法[1-2]、葉綠色a含量測定法[1-3]、可見分光光度法[4]、熒光分光光度法[5-8]、流式細胞顯微計數法[9-11]、庫爾特計數法[11]等。胡先文、侯建軍等先后探討過不同計數方法衡量某一種類微藻生物量的可行性[4,11-13]。然而,因微藻種類不同、形態多樣、細胞大小、不同生長階段細胞組分變化(如葉綠素含量)、甚至地域差異[14],很難有一種計數方法適合所有微藻。顯微鏡計數是較常用、最經典的細胞計數方法,是微藻生物量測定的基本方法,也是確定其他測定方法有效性的依據。但其費時費力,存在一定的人為誤差,不適合分析大批量樣品[13]。

        因此,本實驗在顯微鏡計數基礎上,針對細胞的顯微圖像輪廓,設計并測試了一種單細胞藻類計數的新方法。利用體視顯微鏡及配套的CCD數字成像系統,獲取固定體積樣品的全視野圖像,運用Photoshop軟件,對細胞顯微圖像輪廓進行分析計數。根據細胞粒徑差異,選取5種代表性單細胞藻類,采用新方法和顯微鏡計數法分別計數,分析兩種計數方法之間的差異,并探討了新方法的可行性及應用前景。

        1 材料與方法

        1.1藻種

        實驗用5種藻株由近海海洋環境科學國家重點實驗室(廈門大學)海洋微型藻類保種中心(CCMA)提供。包括:亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)、東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)、米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)、塔瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)和血紅哈卡藻(Akashiwosanguinea)。

        1.2方法

        5種藻株皆用K培養基[15]培養,培養條件:溫度23℃,鹽度30,光照強度60 μE/(m2·s)和光暗周期14 h∶10 h。當細胞生長至指數期時,將藻液放在振蕩器上搖勻后開始取樣,測試濃度梯度分別為:20%、40%、60%、80%、100%,分別用新方法和顯微鏡計數法進行細胞測定。其中,新方法和顯微鏡計數的樣品用2%的Lugol's固定劑固定。樣品稀釋采用滅菌海水。

        1.2.1新方法

        1)制備樣品全視野圖像

        樣品分析前先在振蕩器上充分搖勻,取0.1 mL滴在1 mL無分格浮游植物計數框上,加上蓋玻片,細胞在計數框上平鋪,近均勻分布,少粘連、重疊。同時因樣品體積較小,會在計數框上形成一個近橢圓形區域(圖1a)。在體式顯微鏡(奧林巴斯SZX7,日本)下局部放大觀察,發現基本沒有細胞處于邊界上及邊界外。即:所有細胞處于橢圓區域內,區域內細胞數量即是單位體積生物量。打開配套的萬能視頻成像系統及scopephoto軟件(LY-WN-HP CCD 8,成都勵揚精密機電有限公司),調整視頻流格式及靜態圖像至最大分辨率,手動調節白平衡(R:137、G:88、B:103),選擇自動曝光,顏色設置為黑白模式。微調放大倍數及聚焦(物鏡倍數調整為1.25X),使目標區域完全置于CCD相機視野內,當圖像達到最清晰狀態,抓圖,保存圖片為tif格式。

        2)Photoshop軟件分析

        操作流程:①首先在具有計數工具功能的Photoshop版本(推薦Photoshop CS5 Extended)中打開圖片,利用多邊形套索工具選取細胞計數區域,盡量將視野范圍內的細胞全部包含在選取范圍內,并去除不必要的區域(圖1a);②打開主菜單中—選擇—反向,然后刪除,得到待計數區域(圖1b);③打開主菜單中—圖像—調整—陰影/高光、曝光度和閾值,根據圖片本身適當調節參數(圖1c),調節時盡量提高色階值同時確保沒有新的黑色像素點出現(圖1c);④再次打開主菜單中—圖像—調整—閾值,同樣根據圖片本身適當調節參數(圖中左下),盡量提高色階值并確保沒有新的黑色像素點出現(圖1d);⑤使用魔術棒工具(容差值盡量保證能選中所有黑色像素點),點選白色區域后,主菜單—選擇—反向來選擇細胞點(圖1e),打開主菜單—窗口—測量記錄,選中后打開測量記錄窗口,再打開主菜單—分析—選擇數據點—自定,確保選區—計數勾選(圖1f);⑥再次打開分析—記錄測量,得到計數結果,在結果中右鍵選擇導出保存為txt格式;⑦用Excel打開導出的結果,將面積大小進行排序后,刪除面積最大,偏小和值為1的特征行,即得到原圖中的細胞數量。

        面積偏小和值為1的特征行有可能是圖像采集和處理過程中產生的噪聲點,通常是根據Excel導出結果的中間值來判斷,其面積值遠遠低于中間值。此外,若出現面積相對較大的像素區域,有可能是兩個及以上細胞粘連或疊加的像,為確保原圖中細胞對應的像素點不被誤刪除,需人工校正。如需計數的圖片數量較多,可以使用Photoshop腳本進行批量處理。

        每個樣品設置3個重復,取其平均值。

        1.2.2顯微鏡計數法

        取充分搖勻的樣品0.1 mL滴在浮游植物計數框上,加蓋玻片,在光學顯微鏡(尼康YS-100,日本)下進行細胞計數。每個樣品設置3個重復,取其平均值。

        2 結果與分析

        2.1運用新方法對5種藻不同濃度梯度計數

        實驗選取的5種單細胞藻株:亞心形扁藻(長11~14 μm,寬7~9 μm)、東海原甲藻(長15~25 μm,寬8~15 μm)、米氏凱倫藻(長15.6~31.2 μm,寬13.2~24 μm)、塔瑪亞歷山大藻(長20~52 μm,寬17~44 μm)及血紅哈卡藻(長55~77 μm,寬40~50 μm),細胞大小呈遞增趨勢。從Photoshop處理結果中可以看出:亞心形扁藻細胞個體很小,處理之后的像素點比處理前的細胞輪廓點明顯減少。而東海原甲藻及另外的3株藻,處理前后幾乎保持一致(圖2)。

        2.2兩種方法測定5種藻液不同濃度梯度的線性相關性分析

        根據兩種計數方法對5種藻的分析結果(表1),分別以新方法和顯微鏡計數的結果為自變量,對各濃度梯度進行線性回歸分析(表2),其結果分別為:亞心形扁藻y=50 350x+5 258,R2=0.956 8,y=76 970x+1 798,R2=0.980 6;東海原甲藻y=59 480x-2 578,R2=0.984 6;y=58 540x-926,R2=0.995 8;米氏凱倫藻y=1 488x-40,R2=0.994 1;y=7 800x-108,R2=0.990 2;塔瑪亞歷山大藻y=12 800x+524,R2=0.986 1;y=13 145x+773,R2=0.986 7;血紅哈卡藻y=1 875x-151,R2=0.976 2;y=1 635x+15,R2=0.973 7。各組數據的線性相關系數均大于0.900,表明兩種測定方法與細胞密度梯度線性關系良好。其中,對亞心形扁藻的密度測定,顯微鏡計數法測定的結果線性關系最好、最準確。新方法測定結果的線性關系稍差。而對另外4株藻類進行計數,兩種測定方法線性關系較接近。

        以新方法的計數結果為自變量(x),對顯微鏡計數的標準結果(y)進行線性回歸,結果分別為:亞心形扁藻y=1.494 2x-5 015.6,R2=0.979 0;東海原甲藻y=0.975 7x+1 893.7,R2=0.993 8;米氏凱倫藻y=1.048 2x-65.185,R2=0.995 8;塔瑪亞歷山大藻y=1.025 8x+204.01,R2=0.998 5;血紅哈卡藻y=0.864 8x+153.67,R2=0.981 1。3個相關系數均大于R0.01=0.758(IBM SPSS Statistics 19),說明相關性極顯著,兩種測定方法結果有可比性。在測定東海原甲藻、米氏凱倫藻、塔瑪亞歷山大藻和血紅哈卡藻時,新方法的測定值與顯微鏡計數結果線性關系較好。而在測定亞心形扁藻時,新方法的測定值與顯微鏡計數結果線性關系稍差。

        表1 兩種計數方法的測定結果

        表2 兩種計數方法測定結果的線性回歸分析

        2.3兩種方法測定5種藻液不同濃度梯度的結果比較

        結合表1數據,從圖3柱狀圖可以看出,對5種藻不同濃度計數時,新方法在測定東海原甲藻、米氏凱倫藻、塔瑪亞歷山大藻和血紅哈卡藻時,計數結果與顯微鏡計數結果非常接近,但在測定亞心形扁藻時,結果明顯偏低。

        3 討論

        細胞計數是醫學、環境科學和生物學等領域研究中的重要環節[11]。簡單、快捷、準確的細胞計數方法會給研究工作帶來極大的便利。對于微藻而言,細胞形態多樣,細胞大小相差很大(幾微米到幾百微米不等),又有單細胞、群體之分[14]。因此,很難有一種簡易、快捷、高效計數方法能適合所有微藻,對不同種類的微藻,一般選擇的計數方法也不盡相同。顯微鏡計數是微藻生物量測定的基本方法,也是衡量其他測定方法有效性的依據。但其操作費時費力,重現性不好,存在一定的人為誤差[11,13]。本文在顯微鏡成像基礎上,直接利用顯微鏡配套的CCD數字成像系統獲取樣品全視野圖像,運用Photoshop軟件把細胞圖像輪廓處理成像素點,直接對像素點進行計數。如樣品較多,可以使用Photoshop腳本進行批量處理,簡化了測定程序的同時,省去了人工觀察的步驟,減少了人為誤差。同時,新方法是繞開細胞的大部分內在屬性,直接計算微藻細胞顯微圖像轉換成的像素點,避免了因微藻種類、細胞形態差異、不同生長階段葉綠素含量變化甚至樣品地域差異對葉綠色a含量測定法[1-3]及光密度法[14]等生物量測定方法的限制。另外,新方法使用成本較低,所需硬件及軟件一般實驗室都有配備。

        從本實驗的測定結果可以看出,新方法在測定東海原甲藻、米氏凱倫藻、塔瑪亞歷山大藻和血紅哈卡藻時,結果與顯微鏡計數數據接近,比較可信(P<0.01)。而在測定亞心形扁藻時,結果明顯偏低。主要是因為細胞本身個體較小,樣品體積跟硬件限制(體視顯微鏡成像系統分辨率等),Photoshop處理之后的像素點較分析前細胞輪廓點明顯減少,造成新方法在測定亞心形扁藻時與顯微鏡計數結果明顯偏低。因此,在本實驗的硬件和軟件配置下,新方法的有效計數的細胞大小閾值在15 μm左右。

        新方法在實際應用中具有一定的現實意義。除了能夠有效測定粒徑15 μm以上純種或混合培養的單細胞藻類的生物量外,粒徑15 μm以上的固體顆粒和粉塵等都可以進行準確計數。因此在環境監測、水產養殖、工業制造等領域有一定的應用價值。當然,這種方法的應用也有一些限制因素,如對15 μm以下的藻類細胞計數時,結果偏低;只能對單細胞藻類進行計數,在實際顯微圖像中,受玻片制樣和體視顯微系統景深的影響,可能會出現細胞粘連、重疊的現象。對Photoshop計數結果中面積較大的點,需人工對照原圖進行修正,或采用距離變換和分水嶺算法相結合的分割方法對粘連、重疊顆粒的分割[16]。這已經超出了Photoshop軟件的功能,需要進一步研究新的算法。

        致謝:香港浸會大學李劍平研究員在論文修改中提出了寶貴意見,在此深表謝忱。

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