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一株淡水小球藻的分離純化及鑒定

發(fā)表時(shí)間:2024/03/22 13:21:23  來(lái)源:科學(xué)養魚(yú) 2022年4期  瀏覽次數:2118  
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     一株淡水小球藻的分離純化及鑒定

胡佳文,聶志娟,孫 毅,邵乃麟,李全杰,徐鋼春

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,江蘇 無(wú)錫 214081)

綠藻廣泛分布于淡水中,在海水中也有少量分布,種類(lèi)繁多,包含小球藻、衣藻和團藻等。大多數綠藻都含有葉綠體,可進(jìn)行光合自養,將二氧化碳、氮、磷等無(wú)機營(yíng)養物質(zhì)通過(guò)光合作用轉變?yōu)楦邇r(jià)值次生代謝物,如衣藻富含淀粉和油脂、小球藻含有豐富的蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、氨基酸和多種維生素。因此綠藻可作食品、飼料、化妝品以及藥業(yè)的重要原材料。綠藻物種豐富、分布廣泛,在淡水中的藻類(lèi)品種亦是繁多,為合理地對單一藻種進(jìn)行深入研究和產(chǎn)業(yè)應用,需對淡水中的有益優(yōu)勢藻種進(jìn)行分離純化。本文從鱸魚(yú)養殖水體中分離得到了一株土著(zhù)綠藻優(yōu)勢種。通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀(guān)察,該土著(zhù)藻種的形態(tài)特征與小球藻相似,經(jīng)ITS基因序列分子鑒定為小球藻。

一、材料與方法

1.分離純化

在中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心揚中基地加州鱸養殖池塘中,采集經(jīng)200目篩絹過(guò)濾除去大型浮游生物的水樣置于三角錐形瓶中,加入無(wú)菌BG11培養液進(jìn)行富集光照培養,1周后,顯微鏡下采用微吸管分離選取優(yōu)勢綠藻,并均勻涂布于LB 固體培養基。挑選生長(cháng)較好的單一綠色藻落進(jìn)行下一步的分離純化至顯微鏡下無(wú)其他雜藻可見(jiàn)。培養溫度(25±1)℃,光照周期夜∶晝=12∶12,光照強度3000~5000勒克斯。

2.形態(tài)觀(guān)察

該綠藻優(yōu)勢種經(jīng)過(guò)分離純化后,在LB 固體培養基上光照培養,觀(guān)察藻落形態(tài),在光學(xué)顯微鏡10 倍×40 倍下觀(guān)察并拍照,依據形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步鑒定。

3.分子鑒定

(1)DNA 提取與擴增。采用6540-400 FastDNA Kit(Mpbio)試劑盒提取藻DNA。對ITS 基因序列進(jìn)行PCR擴增。

引物ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’。

ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

PCR 反應體系(25 微升):DNA 模板1.0 微升、引物各1.0 微升(引物濃度10 微摩/升)、Taq Master MIX 12.5 微升、dH2O 9.5 微升,定容至25微升。

PCR 反應程序:95℃5 秒,50℃10 秒,60℃150 秒,35 個(gè)循環(huán),最后10℃保存。PCR 結束后從PCR儀上取下,待下一步處理。

(2)測序測定和分析。PCR 產(chǎn)物純化回收后進(jìn)行測序,將測序結果與NCBI 數據庫中的序列進(jìn)行BLAST在線(xiàn)比對分析,觀(guān)察比對結果,找到與原序列相似度最高的序列,并下載相關(guān)序列。通過(guò)Mega-X 軟件采用鄰接法構建進(jìn)化樹(shù),并建立遺傳距離表,通過(guò)進(jìn)化樹(shù)的聚類(lèi)結果進(jìn)行物種鑒定與遺傳關(guān)系分析。

二、結果

1.形態(tài)特征

光學(xué)顯微鏡觀(guān)察及培養皿培養結果見(jiàn)圖1。藻株直徑在5~10微米。該藻株為單細胞藻,呈圓形或近圓形,表面光滑無(wú)凸起,無(wú)鞭毛。胞體鮮綠色。藻株在光學(xué)顯微鏡下的顏色、大小、形狀都符合小球藻的特征,可初步判定分離的綠藻為小球藻。

圖1 光學(xué)顯微鏡下藻株形態(tài)(左)及培養皿培養(右)

2.分子鑒定

實(shí)驗中擴增到該土著(zhù)綠藻優(yōu)勢種的ITS基因序列,大小約751 bp,序列在NCBI 中進(jìn)行blast 同源性分析,結果顯示該序列與GenBank 中36 條序列具有很高的同源性(96%~100%)。比對結果顯示,與Chlorella sorokiniana isolate SM12_1(KM514859.1)的序列相似性最高,為100%,其次是Chlorella vulgaris isolate liming lake 1(MN103781.1)。獲取同源序列后,使用megaX 內置的clustal W 進(jìn)行多序列比對,使用NJ 模型構建進(jìn)化樹(shù),設定bootstrap 為1000,選擇Marvania coccoides CCAP 251/1A(FR865696.1)作為外類(lèi)群。進(jìn)化樹(shù)結果顯示,與Chlorella sorokiniana isolate SM12_1(KM514859.1)聚為一支,同源性最高,自展值為100%,統計置信度處于非常顯著(zhù)的水平且遺傳距離最小,為0.0040。進(jìn)化樹(shù)結果與比對結果一致得出,分離純化的優(yōu)勢綠藻種為chlorella sorokiniana isolate SM12_1,屬于綠藻門(mén)、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬。

三、討論

本文通過(guò)微吸管分離和平板純化分離出一株綠藻優(yōu)勢種,并通過(guò)形態(tài)學(xué)以及分子生物學(xué)鑒定明確了該藻株為小球藻。

本實(shí)驗用顯微鏡觀(guān)察藻株形態(tài)發(fā)現細胞壁、胞體直徑、顏色等形態(tài)特征與小球藻相符。形態(tài)特征雖然是分類(lèi)學(xué)的重要依據之一,但不一定精確。在水生生態(tài)系統中,許多浮游藻類(lèi)存在表型可塑性,即一種基因型在不同的環(huán)境條件下呈現多種表型的現象(楊州,2008)。浮游藻類(lèi)可能產(chǎn)生不同的表型以應對外界環(huán)境條件的變化,改變自身形態(tài)形成群體或集聚是最常見(jiàn)的一種形式(Huang,2018)。溫度、pH、鹽度等非生物因素可能誘導藻類(lèi)發(fā)生形態(tài)變化,細菌、沉水性植物也可改變藻類(lèi)表型。有研究發(fā)現金魚(yú)藻對小球藻有顯著(zhù)的形態(tài)和生長(cháng)效應(常孟陽(yáng),2019)。普通小球藻對菹草有形態(tài)響應,可促進(jìn)小球藻群體的形成(常孟陽(yáng),2019)。因此,僅僅依據形態(tài)學(xué)來(lái)鑒定物種結果可能會(huì )出現差錯。分子鑒定相比較形態(tài)學(xué)鑒定結果更精確。微藻體積微小,但對整個(gè)微藻進(jìn)行DNA測序工作量大且成本高昂,因此通常選取特異性基因片段進(jìn)行PCR擴增,將擴增產(chǎn)物克隆測序后與基因數據庫中序列進(jìn)行同源性比對,最終確定微藻的分類(lèi)學(xué)地位。核基因組編碼的ITS序列變異位點(diǎn)數量豐富(曲凌云,2008),是一個(gè)理想的微藻鑒定基因。由于小球藻形態(tài)特征明顯,綜合考慮鑒別效率和精確性,可先通過(guò)形態(tài)學(xué)大致判定種類(lèi),再結合分子鑒定進(jìn)一步確認。

小球藻培養過(guò)程中積累了大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖和類(lèi)胡蘿卜素等高價(jià)值代謝產(chǎn)物,是天然綠色的魚(yú)苗開(kāi)口餌料,也是蝦類(lèi)、貝類(lèi)的優(yōu)質(zhì)餌料,還是用來(lái)培育供魚(yú)苗攝食的動(dòng)物性餌料如輪蟲(chóng)、枝角類(lèi)等的優(yōu)質(zhì)基礎餌料。此外,小球藻可以用來(lái)進(jìn)行生物廢水修復以及水質(zhì)治理,治理效率高、成本低并且生態(tài)環(huán)保。因此,小球藻規?;ㄏ蚍€定培養具有很大發(fā)展前景。本文分離純化一株綠藻并鑒定為小球藻,助力綠色養殖模式建立,豐富小球藻種質(zhì)資源,有助于推動(dòng)小球藻規?;ㄏ蛏a(chǎn)。

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